طرح"مطالعه پیش بالینی بررسی افزایش بقا و حفظ سلول در پیوند همزمان هیدروژل سلولی و میکرووزیکل های Integrin-ꞵ1 در مدل انفارکته قلبی در حیوان خرگوش"

مصوبه: دانشگاه علوم پزشکی تهران/پژوهشکده بیماریهای قلب و عروق/م ت فناوریهای نوین قلب و عروق

وضعیت: در حال اجرا

مجری: دکتر سیدحسین احمدی تفتی

مقدمه و بیان مسئله:

بیماری های قلبی عروقی (CVDs) علت مرگ و میر بالا در کشورهای صنعتی و در حال توسعه می باشد(۱). در ایالات متحده تنها حدود یک میلیون انفارکتوس قلب (MI) سالانه اتفاق می افتد و بسیاری از این بیماران با تشخیص نارسایی قلبی هستند که در حال حاضر در ۵ میلیون بیمار تشخیص داده می شوند(۴-۲). با توجه به تعداد زیادی از بیماران و درمان با هزینه بالا، CVDs یک بار مالی جدی را نشان می دهند (۲،۵). بیماری های قلبی عروقی شامل اختلالات مختلفی هستند که بر قلب و عروق اثر می گذارند: بیماری های قلبی عروقی، بیماری های مغزی، بیماری شریانی محیطی، بیماری قلب روماتیسمی، بیماری های قلبی مادرزادی، ترومبوز ورید عمقی و آمبولی ریوی. در میان این موارد، شایع ترین ایسکمی بافت همراه با بیماری های قلبی عروقی، سکته مغزی و بیماری شریانی محیطی است که به طور کلی بیش از نیمی از موارد بیماری های قلبی را شامل می شوند(۵).
تا همین اواخر، گفته می شد قلب یک ارگان تمایز یافته است که قادر به ترمیم خود نیست. گر چه، یافته های اخیر ثابت کرده اند که در سن ۲۰ سالگی میزان خود تجدید شوندگی سلول های قلبی ۱ می باشد، در حالی که در۷۰ سالگی به ۰.۴ درصد در سال کاهش می یابد (۳،۶). جدای از این، بار بیش از حد قلب و یا فرایند پیری با کاهش قابل توجهی از کاردیومیوسیت ها ( تا ۲۰ میلیون سالانه) همراه است. علاوه بر این، یک رویداد حاد مانند MI باعث از بین رفتن بیلیون ها سلول می شود که ۲۵ درصد کل توده قلب را درگیر می کند(۲). از آنجایی که کاردیومیوسیت ها ذاتا به میزان اندکی بازسازی می شوند، جبران سلول های ازبین رفته بوسیله تشکیل بافت اسکار فیبروتیک که باعث کاهش و اختلال در انقباض قلبی می شود، به وجود می آید(۳).
در حال حاضر هیچکدام از راهکارهای دارویی یا جراحی برای پیشگیری از آسیب ناشی از ایسکمی و برای ترمیم کامل بافت آسیب دیده قلب وجود ندارد (۷). علاوه بر تقارن مجدد انقباض قلبی، آنژیوپلاستی و یا دستگاه های کمک کننده بطنی، چندین دارو برای کنترل فشار خون یا دیس لپیدمی و نیز کنترل بیماری های متابولیکی مورد استفاده قرار می گیرند. به طور خاص، تمام درمان های دارویی فعلی که در نارسایی قلبی استفاده می شوند، عمدتا تسکین دهنده هستند: آنها در بهبود کیفیت زندگی مفید هستند، اما قادر به تغییر روند بیماری نیستند. در این راستا، تنها گزینه درمانی پیوند قلب است. به طور مشابه، در درمان MI، حتی موفق ترین پیشرفت ها در عمل جراحی محدود به بهبود ذخیره خون از طریق دستکاری عروق بزرگ است (۸). در عین حال، یکی از مکانیسم های کلیدی برای شرایط غیر قابل عمل قلب میکروآنژیوپاتی است که در آن عدم وجود میکروسیرکولاسیون باعث ایجاد ایسکمی می شود. ازاینرو، پیشرفت های پزشکی فعلی قادر به تغییر در روند MI نیستند. به این ترتیب، وضعیت فعلی درمان برای بیماری های قلبی عروقی کافی نیست و توسعه درمان های جایگزین ایمن و کارآمد ضروری است. درمان مبتنی بر علوم نوینی همچون پزشکی ترمیمی؛ ژن و یا سلول های بنیادی و ترکیب آنها و نیز دیدگاه مهندسی بافت مبتنی بر طراحی و ترمیم بافت صدمه دیده یکی از استراتژی های امیدوار کننده است. در مقایسه با درمان های مورد استفاده فعلی، سلول های بنیادی با قابلیت تمایز به کاردیومیوسیت قادر به تحریک و تقویت مکانیسم های درونی قلب هستند و بنابراین بنیانی برای ترمیم کامل بافت آسیب دیده قلب را فراهم می کنند.
دو نوع اصلی از سلول های بنیادی (SCs) در حال حاضر برای پزشکی ترمیمی قلب مورد استفاده قرار می گیرند: (۱) سلول های بنیادی چند توان بالغ و (۲) سلول های بنیادی پرتوان جنینی (ESCs) و SCs پرتوان القا شده (iPSCs)، که مشتقات تمایزیافته آنها برای پیوند مورد بررسی قرار می گیرند یا پس از پیوند سلول ها در محل تمایز می یابند (۱۱-۹). به عنوان درمان های بالقوه، هر دو گروه دارای مزایا و معایب خاصی هستند (۱۰،۱۱). ESCs و iPSCs مزایای قابل توجهی دارند: پرتوانی، گستردگی کارآمد در شرایط آزمایشگاهی، در دسترس بودن تعداد بالا سلول و امکان ایجاد بانک سلولی و تولید انبوه آنها(۱۲،۱۳). علاوه بر این، در مورد iPSC ها، سلول های اتولوگ برای پیوند در دسترس هستند. در عین حال، احتمال تشکیل تراتوم به دلیل باقی ماندن برخی از سلول های پرتوان در بین سلول تمایز یافته نهایی و یا اختلال در تمایز در محل آنها وجود دارد (۱۲). علاوه بر این، آماده سازی محصول درمان نهایی با این سلولها - تکثیر و یا تمایز - نیاز به کشت طولانی مدت دارد. این، به نوبه خود، می تواند منجر به بالا بردن miRNAs شود که معمولا در سرطان ها یافت می شود و احتمال ناهنجاری های ژنتیکی و اپی ژنتیکی را افزایش دهد (۱۱). مهم تر اینکه استفاده از ESC، سال ها بحث های جدی اخلاقی و قانونی را برانگیخته است(۱۱).
اما SC بالغین شامل جمعیت های مختلف سلول های بنیادی و پیش ساز، جدا شده از منابع مختلف، از جمله مغز استخوان، خون محیطی یا بافت های بدن هستند. معمولی ترین انواع آنها : سلولهای تک هسته ای مشتق از مغز استخوان، سلول های بنیادی هماتوپوئتیک، سلول های پیش ساز اندوتلیال، SCs قلبی (CSCs) و سلول های بنیادی مزانشیمی (MSCs) هستند. توسعه بالینی آنها برای درمان بیماران قلبی بسیار زیاد است: بیشترین روش بالینی است که تا کنون مورد استفاده قرار می گیرد. تعداد روزافزون کارآزمایی های پره کلینیکال و کلینیکال منجر به نتایج مثبت جدی در زمینه پیوند سلول های بنیادی و سلول پیش ساز بالغین در درمان CVD شده است. درکل، استفاده بالینی از SC بالغین با یک شواهد مشخصی از کارازمآیی بالینی ثابت شده است که برای پیوند ایمن هستند؛ بنابراین، مطالعات فاز دوم و سوم می تواند آغاز شود. در عین حال، اگرچه ایمنی و امکان سنجی این انواع مختلف سلول ها در چندین کارآزمایی بالینی اثبات شده است، نتیجه مفید برای عملکرد قلبی معمولا بسیار محدود است (۳،۱۴،۱۵). بویژه، موفقیت آمیزترین نتایج از CSC ها بدست آمده است (بهبود عملکردی ~ ۱۰ در کارآزمایی بالینی فازI) (۱۷, ۱۶), در حالی که سایر انواع سلول های معمول بکار برده شده منجر به نتیجه سودمند ۳-۵ یا بدون اثر مثبت بوده اند (۱۸). کاربرد بالینی آنالوگهای "سلولهای بنیادی سنتزی" گزینه دیگری برای غلبه بر موانع پیش رو در درمان با سلولهای بنیادی می باشد، از جمله پایداری ذخیره محصول سلولی، تحریک یک واکنش ایمنی و تومورزایی ناشی از پیوند سلول (۱۹).
تجزیه و تحلیل کارآزمایی های موجود مشکلات و چالش های فعلی پیش رو سلول درمانی برای بیماری های قلبی عروقی نشان می دهد. اول، علیرغم اینکه بیشترین کارآزمایی های بالینی در مورد SCS بالغین آغاز شده، تجزیه و تحلیل نتایج آنها به چالش کشیده می شود. دلایل اصلی ناسازگاری در انتخاب بیماران و تغییر در انتخاب جمعیت سلولی است. محدودیت های دیگر درمان SC های بالغ زیر شامل: دسترسی به تعداد کم سلول های حاصل از مغز استخوان، ظرفیت تکثیر SCS بالغ در محل که در مقایسه با ESCs و iPSCs محدود است، و SCS بالغین محدود به یک رده خاص هستند. علاوه بر این، ظرفیت ترمیم کنندگی سلول ها با سن کاهش می یابد و سلول های پروژنیتور محرک در بدن نیز ممکن است فاقد قابلیت با افزایش سن باشند (۲۲-۲۰). انتقال تعداد کافی سلول ها به محل آسیب نیز موضوع چالش برانگیز باقی مانده است. در حال حاضر، بدون در نظر گرفتن روش های تجویز، میزان ابقا سلول در چند دقیقه اول تا ساعت ها پس از تزریق کمتر از ۵ تا ۱۰ درصد گزارش شده است (۲۵-۲۳). پس از تزریق، پتانسیل ترمیم سلول ها اغلب با اتصال و بقا ضعیف در بافت های ایسکمیک مواجه هستند (۲۷، ۲۶). این عوامل ممکن است حداقل بخشی را توضیح دهد که چرا مزایای درمانی استفاده از SC بالغین بسیار محدود است (بهبودی عملکردی ۴-۵) (۱۸). علاوه بر انتقال ضعیف تعداد کافی سلول ها، اثرات تراتوژنیک و سرطان زایی یکی از بزرگترین نگرانی ها در مورد کاربرد ESC و iPSC باقی می ماند. ازاینرو، نتایج محدود SC به مداخله فوری بهبود در خواص درمانی انواع سلول های اعمال شده به منظور افزایش تاثیر آن بر بازسازی قلبی نیازمند است.
استراتژی هایی در بهبود درمان های مبتنی برسلول پیشنهاد می شوند. نظیر انتخاب سلول مناسب از منابع در دسترس؛ ماهیت و مارکر مناسب سلول در بافت هدف گزینه دیگر در انتخاب سلول است. سلولهای مارکر c-kit مثبت بیشتر در دهلیز هستند و در آپکس بطن حداقل می باشند از طرفی کاردیوسفرها نیز بزرگ بوده ( بیش از ۲۰۰ میکرومتر) و احتمال میکروآمبولی در تزریق داخل کرونری وجود دارد. هرچند بهبود روشهای ساخت میکروسفر اندازه را توانسته به ۵۰-۱۰۰ میکرومتر برساند و در تجویز کرونری مناسب باشد که بر خوکچه هندی امتحان گردیده است(۲۸). اصلاح روش انتقال سلول بنیادی؛ تاکنون دو روش عمده تجویز سلول در مطالعات پیش بالینی و بالینی بکاربرده شده اند. تزریق سیستمیک داخل وریدی و پیوند موضعی داخل عضله (۲۹).گرچه تزریق داخل وریدی نسبت به پیوند موضعی آسان و کمتر تهاجمی است، میزان گسترده ای از سلول های تزریق شده در کل بدن پخش شده و عمدتا در کبد، ریه و طحال جمع می شوند(۳۰،۳۱). که این استراتژی عمدتا ظرفیت هومینگ و حفظ سلول را تحت تاثیر قرار می دهد(۳۲). ازاینرو، تزریق مستقیم به عضله در مطالعات پیش بالینی و کارآزمایی بالینی ترجیح داده می شود. با این وجود انگرفت و پیوند سلول بعد از تزریق ناکارامد باقی مانده است. مطالعات در مدل های بزرگ و کوچک حیوانات، به عنوان مثال، خوک ها، نشان داد که بیش از ۹۰ درصد از سلول ها در ساعات اول پس از پیوند شسته می شوند (۳۵-۳۳، ۲۹). بنابراین، استفاده از SCs برای بازسازی قلب نیازمند همراهی با توسعه تجهیزات مناسب برای اطمینان از اینکه محصول سلول به مقصد می رسد، است. چندین راهبرد انتقال پیشرفته با اطمینان از انتقال حداقل تهاجمی و هدفمند سلول به میوکارد پیشنهاد شده اند، از جمله کاتتر تزریق سه بعدی MyoStar® همراه با سیستم نقشه برداری الکترومکانیکی NOGA®، سیستم های هدایت ۲بعدی فلوروسکوپیک کاتتر تزریق Helix ™ و MyoCath ™ (۳۶،۳۷). استفاده از بیومواد استراتژی دیگری است که نقش چشمگیری در حفظ سلول در ناحیه انفارکته دارد. به عنوان مثال انکپسولاسیون سلولی با استفاده از هیدروژل ها اجازه کنترل میکرومحیط بر کاربرد سلول را می دهد. انتقال سلول ها با کمک بیومواد توسط تزریق یک ترکیب ماتریکس و سلول های بنیادی به قلب و یا پیوند پچ سلول-ماتریکس انجام می شود. هر دوی این ها باید با قابلیت زیست سازگاری و زیست تخریب داشته باشند و نیز در اثر تخریب مواد غیر سمی تولید کنند(۳۸). رویکرد مبتنی بر تزریق نیاز به بیومواد مایع دارد که بلافاصله بعد از پیوند جامد شوند (۳۸). هیدروژل های با ابعاد میکرون گزینه های جذابی هستند زیرا نه تنها تبادل مواد غذایی و ضایعات متابولیکی طی رشد سلول و توسعه بافت را ارتقا می بخشند، بلکه همچنین قادرند خواص فیزیکی و شیمیایی را تنظیم نمایند. و شرایط نزدیک به بافت بدن از لحاظ نسبت داربست و سلول و ارتباط سلولها با یکدیگر و داربست را فراهم آورد. علاوه بر این بیومواد می توانند حاوی مولکول های فانکشنال موثر در انتقال سلول باشند نظیر فاکتور رشد شبه انسولین ۱ (IGF-۱)، فاکتور مشتق از استروما ۱ (SDF-۱) و فاکتور رشد تغییرشکل دهنده بتا (TGF-β ) (۴۰-۳۸، ۲۹). همچنین، داربست های توسعه یافته با افزایش سطح اکسیژن در محل پیوند برای چندین ساعت تا چندین روز که بقا و تکثیر سلول های بکاربرده شده را بیشتر بهبود می بخشد(۴۲-۴۰). از بین بیومواد ماتریژل، کاردیوژل، فیبرین و کلاژن زیست تخریب پذیرند و اتصال، تمایز و تکثیر انواع مختلف سلول های بنیادی مثل سلول بنیادی جنینی یا مشتق از مغز استخوان در مطالعات بر حیوانات کوچک و بزرگ را نشان داده اند(۲۹،۳۸).
در شرایطی که در پزشکی ترمیمی، سهولت دستیابی به سلولهای بنیادی فاکتور مهمی در نظر گرفته شده است، می توان این فرضیه را مطرح نمود که سلولهای بنیادی اندومتریال رحم در محیط القاء مناسب، می توانند به کاردیومیوسیت تبدیل شوند و با توجه به دلایل زیر منبع مناسبی برای بازسازی بافت قلب بشمار می آیند: به آسانی قابل دستیابی است، نسبت به سلول های مغز استخوان جمعیت خالصتری دارد، با توجه به سرعت تکثیر زیاد آن امکان بانک نمودن آن وجود دارد(۴۳) و با توجه به اینکه خاصیت آلوژنیک آن به اثبات رسیده است، می تواند در افراد مختلف نیز مورد استفاده قرار گیرد(۴۶-۴۴). با این حال، به عنوان نتایج امیدوارکننده، پروتکل های بسیار پیشرفته تر، داده های بیشتر، و اثبات های طولانی مدت ایمنی مورد نیاز است تا سلول ها در کاربرد گسترده بالینی آورده شود.

ما در این طرح بر آن شدیم که با توجه به سهولت دستیابی به سلول های بنیادی اندومتریوم، رگزایی و عدم تومورزایی و نیز جمعیت سلولی خالص تر نسبت به سلول های بنیادی مغز استخوان و سرعت تکثیر بیشتر، از این سلول ها در درمان بیماری قلبی مبتنی بر سلول درمانی استفاده کنیم. همچنین، در این مطالعه از میان روش های مختلف ارائه شده برای کشت سه بعدی، تولید میکروسفیر حاوی سلول سلول بنیادی اندومتریال و اینتگرین بتا ۱ را با استفاده از سیستم میکروفلوئیدیک طراحی و توسعه داده خواهد شد تا محدودیت‌های روش متداول نظیر پراکندگی قطره میکروهیدروژل کروی در طول فرایند تولید و همچنین زمان‌های عملیاتی که به عنوان یک عامل کلیدی در فرایند انکپسیلاسیون می باشد کمک شود.
با استفاده از این روش و به منظور بررسی تاثیر بر هم کنش های بین سلولی بر روی رشد و شکل گیری بافت قلبی، سلول های بنیادی مزانشیمی استخراج شده ، در داخل میکرواسفیر هایی از جنس پلیمر هیالورونیک اسید به صورت همزمان کشت داده می شوند. علت انتخاب پلیمر هیالورونیک اسید برای ساخت میکروکپسول ها این است که این ماده از اجزای اصلی ماتریکس طبیعی بافت قلبی بوده و بنابراین انتظار می رود بر هم کنش مناسبی با سلول های قلبی داشته باشد. هدف نهایی از این طرح، دستیابی به تجمعات اسفروییدی قابل استفاده در مهندسی بافت قلبی است.