طرح "بررسی اثربخشی اگزوزوم های غنی شده با ATP مشتق از سلول های بنیادی مزانشیمی(MSC) اصلاح سطح شده با RGDبه منظور ارسال هدفمند به بافت آسیب دیده ی قلب رت پس از MI"

مصوبه: دانشگاه علوم پزشکی تهران/پژوهشکده بیماریهای قلب و عروق/م ت فناوریهای نوین قلب و عروق

وضعیت: در حال اجرا

مجری: دکتر سید حسین احمدی تفتی

مقدمه و بیان مسئله:

در دهه های اخیر بیماری های قلبی عروقی به عنوان عامل اول مرگ و میر در دنیا شناخته شده است (۱). سکته قلبی از رایج ترین بیمار های قلبی عروقی هستند که در آن ها میوکارد دچار نقص در عملکرد مناسب و ناتوان در پمپاژ خون می گردد . در دهه های گذشته، پیوند اعضا راه حل نهائی درمان نارسایی های قلبی به شمار می رفت که علیرغم محدودیت های بسیار، همچنان به عنوان موثرترین گزینه درمانی شناخته می شود. با این حال، با وجود پیچیدگی های لاجستیک، موانع پزشکی پیوند قلب و کمبود اهدا کننده سبب می شود که ۲۰ درصد بیماران در لیست انتظار جان خود را از دست بدهند (۲). در کل، چالش هایی از قبیل کمبود شدید اهدا کننده ی پیوند، احتمال رد پیوند و مشکلات ایمونولوژیکی بعد از پیوند (۳) ضرورت دستیابی به روش های درمانی جایگزین از جمله پزشکی بازساختی را بیش از پیش مشخص نموده است. با وجود اینکه، سلول درمانی از مهمترین ارکان این علم به شمار می رود اما در سال های اخیر با موانع و مشکلات زیادی مواجه شده است. ازین رو روش های پزشکی بازساختی به سمت پزشکی بازساختی بدون استفاده مستقیم از سلول های بنیادی حرکت کرده است. چراکه در این روش ها بجای تزریق/پیوند سلول های بنیادی به بیمار، فرآورده های بیولوژیکی سلول های بنیادی به بیمار تزریق می گردد.
سلول های پیش ساز قلبی: اگزوزوم های مشتق از سلول¬های پیش¬ساز قلبی مهاجرت اندوتلیال سل¬ها را به بافت دچار انفارکتوس شده¬ی قلبی تحریک می-کنند و برای بازسازی و رگزایی این بافت آسیب دیده مفید می¬باشند. اگزوزوم¬های رها شده از سلول¬های پیش¬ساز قلبی در انتقال فاکتورهای پیش زنده¬ مانی و ضد آپاپتوزی به سلول های قلبی نقش دارند [۵۵]. در مدل های MI تزریق اگزوزوم¬های مشتق از سلول¬های پیش¬ساز قلبی اثرات مفیدی را به خاطر کاهش دادن آپاپتوز و سایز ناحیه ی انفارکتوس و افزایش توده میوکارد و آنژیوژنز نشان داده اند. این نتایج پیشنهادکننده¬ی پتانسیل درمانی اگزوزوم های قلبی پس از انفارکتوس می¬باشند [۴۶, ۵۶, ۵۷]. اگزوزوم های مترشحه از پیش ساز سلول¬های قلبی همچنین موجب تحریک مهاجرت سلول های اندوتلیال می¬شوند [۴۳]. در آسیب کبدی سلول های اپی تلیال کبدی تحت انتقال اپی تلیال به مزانکایمال قرار می¬گیرند و موجب تبدیل فیبروبلاست ها به میوفیبروبلاست از طریق ارتقاء بیان کلاژن I، F-اکتین و α-اکتین ماهیچه صاف می شوند [۵۸]. بیشترین اثر بازسازی اگزوزوم های مشتق از سلول¬های پیش¬ساز قلبی زمانی مشاهده می¬شود که اگزوزوم ها به داخل ناحیه ی آسیب دیده MI تزریق شوند [۱۹]
کاردیومیوسیت ها در طول دوران جنینی پستانداران تکثیر می¬شوند و پس از تولد، با وجود تقسیم هسته سیتوکینز اتفاق نمی افتد [۹-۱۱]؛ بنابراین در حدود ۹۰% سلول های میوکاردیوم افراد بالغ بصورت دو هسته ای هستند. سلول های کاردیومیوسیت قلب انسان که عمل اصلی انقباض را انجام می¬دهند قادر به بازسازی و تکثیر می¬باشند، اما سرعت آن به حدی کند و ضعیف است که عملا موثر نخواهند بود. اما برعکس در مطالعه ای بر روی زبرا فیش بررسی های اولیه نشان داده اند که پس از آسیب و جراحت، سلول¬های اپیکاردیوم فعال شده و موجب بازسازی قلب می¬شوند [۱۳]. نرخ بازسازی قلب با استفاده از کربن ۱۴ نشان داده است که تنها حدود ۱% از قلب افراد ۲۵ ساله در سال توانایی بازسازی دارد و این میزان برای افراد ۷۵ ساله به ۰.۴۵% کاهش می یابد [۱۲]. این مطالعات نشان داده اند که میوکاردیوم های جدید از طریق تمایز زدایی و تکثیر کاردیومیوسیت های موجود ایجاد می شوند تا سلول های بنیادی دلیل این امر به این خاطر است که تعداد سلول های بنیادی در بدن موجودات بسیار اندک می¬باشد [۵]. مطالعات سلول درمانی نیز نشان می دهند سلول درمانی و استفاده¬ی مستقیم از سلول های بنیادی برای بازسازی بافت قلب ناکارامد می باشد چرا که احتمال لانه گزینی آنها در محل آسیب دیده بسیار کم است و از طرف دیگر به خاطر ایجاد التهاب در محل آسیب دیده توانایی زنده مانی، رشد و تکثیر آنها کاهش خواهد یافت. بنابراین استفاده از حامل های اگزوزومی به عنوان وزیکول های خارج سلولی که بطور طبیعی در بدن تولید می شوند و رابط بین سلول ها و بافت های مختلف می باشند برای بازسازی بافت قلب مناسب به نظر می رسند.
سلول های بنیادی مزانشیمی (MSCs) از طیف وسیعی از منابع مشتق شده و به راحتی جداسازی و کشت می شوند. سلول های بنیادی مزانشیمی ظرفیت تکثیر و خود نوسازی در شرایط آزمایشگاهی، خاصیت ایمنوژنسیتی پایینی دارند و تحت شرایط خاصی، سلول های بنیادی مزانشیمی را می توان به انواع سلول ها تمایز داد. در سیستم قلبی عروقی، سلول های بنیادی مزانشیمی می توانند با کاهش سطح التهاب، تمایز سلول های میوکارد در اطراف نواحی انفارکتوس و رگ زایی، افزایش مقاومت به آپوپتوز و مهار فیبروز که کیفیت ایده آلی برای ترمیم قلب و عروق دارند از میوکارد محافظت می کنند. مطالعات پیش بالینی نشان داده‌اند که سلول‌های بنیادی مزانشیمی می‌توانند پیوند شوند و ترمیم قلب را بهبود بخشند، اما چالش‌هایی مانند سرعت کم مهاجرت آن‌ها به میوکارد ایسکمیک، احتباس بافتی کم و نرخ بقای پایین پس از پیوند همچنان باقی است.
وزیکول‌های خارج سلولی مشتق از MSC نشان داده شد که اتوفاژی قلب را از طریق مسیرهای AMPK/mTOR و Akt/mTOR افزایش می‌دهند و رگ‌زایی توسط فاکتور ۱α القایی هیپوکسی (HIF-۱α) که آپوپتوز سلولی را کاهش داده، فعال می‌کنند. مسیر سیگنال دهی بقای سلول از طریق میکروRNA های متعدد (miRs)۱۹،۲۰،۲۱. اخیراً، استراتژی‌های مختلفی برای افزایش اثرات درمانی سلول‌های بنیادی مزانشیمی، از جمله اصلاح ژنتیکی و ترکیب آن‌ها با مواد بیولوژیکی، ایجاد شده است.
اگزوزم ها وزیکول های دولایه ی تولید شده توسط سلول است که حامل پروتین های سطحی، مارکرها، پروتین ها، نوکلئیک اسید ها، و برخی RNA های غیر کد شونده و برخی میر های مهم است که سایزی بین ۳۰-۱۲۰ نانومتر دارد.
اگزوزوم های مشتق از سلول های بنیادی مزانشیمی حاوی فاکتور رونویسیCXCR۴ است که موجب افزایش بیان VEGF و تشکیل عروق خونی می شوند [۴۰]. CXCR-۴ یک گیرنده¬ی جفت شده با پروتئین G می¬باشد و می تواند چندین مسیر سیگنال رسانی پائین دستی را با واسطه¬ی G پروتئین پس از تحریک فعال کند [۴۱, ۴۲]. CXCR-۴ یک فاکتور اساسی در لانه گزینی و مهاجرت سلول های اندوتلیال می¬باشد [۴۳]. تیمار سلول های بنیادی یا پیش ساز قلبی با اگزوزوم های غنی شده ی CXCR-۴ می تواند موجب کاهش مرگ سلول ها بخاطر MI و ارتقاء رگزایی از طریق مسیر پیام رسان PI۳K/Akt شود و از اینرو عملکرد قلب را بهبود بخشد [۴۰]. در حوزه تشخیصی نیز می¬توان از اگزوزو¬م¬ها بهره گرفت؛ اگزوزوم ها می¬توانند از طریق کلیه ها وارد ادرار شوند و شناسایی آنها می¬تواند به عنوان ابزارهای تشخیصی مورد استفاده قرار گیرد. این حامل ها در ادرار می¬توانند به عنوان مارکری در درمان سرطان پروستات موثر باشند [۴۴]. از اگزوزوم های موجود در ادرار برای تشخیص های پاتولوژی نیز استفاده شده است برای مثال از روی پروتئین ها و miR آن ها می¬توان فشار خون مینرالوکورتیکوئید را تشخیص داد[۴۵]. در سال ۲۰۱۹، Xu و همکارانش با بررسی اگزوزوم های تولید شده توسط سلول های سوماتیک موجود در قلب در مطالعات مختلف، شامل کاردیومیوسیت ها، فیبروبلاست ها، سلول های اندوتلیال و سلول های پیش ساز قلبی (CPC)، آدیپوسیت ها و تلوسیت های قلبی به این نتیجه رسیدند که بیشتر این اگزوزوم ها به میزان قابل توجهی باعث مهار آپوپتوز، نقص عملکرد، فیبروزه شدن شده اند و آنژیوژنز و خواص ضد آسکروزیس را فعال می کنند(۴). همچنین Balbi و همکاران (۲۰۲۰) در مطالعه ای مروری دیگر، بابررسی اثر اگزوزم های مشتق شده از سلول های بنیادی مختلف از جمله سلول های بنیادی مزانشیمی، سلول های پیش ساز قلبی، سلول های بنیادی جنینی و سلول های iPSCs، نشان دادند که هر کدام از این اگزوزوم ها در مقادیر متفاوتی می تواند به ترمیم وبازسازی عضله قلبی بعد از MI کمک کنند(۵). مطالعات اخیر کشف کرده اندکه این سلولهای بنیادی مزانشیمی قادر به ترشح اگزوزوم های فسفولیپیدی غنی از کلسترول بودند که با microRNA ها غنی شده اند و بر روی قلب و عروق عمل کرده، و با اثرات ضد آپوپتوزی، بازسازی قلبی، ضد التهابی، رگ زایی تغییر وضعیت عروق را نیز نشان می دهند(۶). شاهدی از این مورد را می توان به مطالعات در سال ۲۰۱۵، Teng و همکارانش اشاره کرد. این گروه نشان دادند که تزریق مستقیم میوکاردیال اگزوزم های مشتق از سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق از مغز استخوان به مدل رت دچار MI نه تنها باعث کاهش سایز ناحیه دچار ایسکمی، بلکه حفظ کارایی سیستول و دیاستول قلبی نیز می شود (۷). همچنین در سال ۲۰۱۸، از تزریق میوکاردیال اگزوزم های مشتق از سلول های بنیادی مزانشیمی مشتق بند ناف انسان در تحقیقات Wang و همکارانش به عنوان مثالی دیگر به مدل رت دچار MI به وسیله مهار miR ۱۲۵b ۵p باعث افزایش بازسازی ناحیه آنفارکته می شود نام برد(۸). در مطالعه ای که Gao و همکاران روی حیوانات بزرگ انجام دادند، مشاهده کردند با تزریق مستقیم اگزوزم های استخراج شده از hiPSC-derived cardiac cells به مدل خوک های دچار سکته، میتوان بدون اینکه تغییری در آریتمی ها ایجاد شود میزان بازسازی قلبی را افزایش داد(۱۱).
میتوکندری ها که از جمله فرآورده های بیولوژیک سلول های بنیادی است، علاوه بر وظیفه ی تولید بالای انرژی ، در تنظیم طیف وسیعی ازفعالیت های سلول همچون آپوپتوز، تکثیر، هموستاز نقش اساسی ایفا می کنند لذا اختلال در آنها می تواند عامل بسیاری از بیماری ها باشد. علاوه بر اگزوزم ها، می توان با تزریق میتوکندری های زنده و فعال در درمان برخی از بیماری های قلبی و خصوصا ایسکمی های قلبی از آن ها بهره برد (۱۲, ۱۳). از آنجایی که قلب به انرژی و ATP نیاز بالایی دارد، میتوکندی ها حدود ۳/۱ از حجم سلول های قلبی را اشغال می کنند و وابستگی بسیار زیادی به تامین مداوم اکسیژن توسط عروق کرونری قلب دارند. ایسکمی در کاردیومیوسیت ها حاصل از انسداد عروق کرونری موجب تغییردر فعالیت ، عملکرد و در نهایت کاهش تولید ATP توسط میتوکندری و اختلال در عملکرد این سلول قلبی می شود (۱۶). چراکه میتوکندری با تولید ATP نقش حداکثری در عملکرد و زنده مانی کاردیومیوسیت ایفا می کند.
ATP، آدنوزین تری فسفات رایج ترین شکل انرژی قابل استفاده برای سلول است. عملکرد قلبی نیز بسیار وابسته به ATP می باشد، که بوسیله ی اکسیداسیون سوبستراهای متفاوتی انجام می پذیرد [۹۰]. در هنگام ایسکمی، سلول های قلبی ناچارند به جای اکسیداسیون هوازی که حدود ATP ۳۸ تولید می کند به سمت تولید ۲ ATP حاصل از اکسیداسیون بی هوازی بروندکه این مسیر جایگزین به دلیل کمبود اکسیژن ناکافی در سلول قلبی رخ می دهد که خود، موجب ایجاد متابولیت های اسیدی در داخل سلول می شود. بنابراین کاهش توام ATP همراه با افزایش اسیدیته محیط به منزله ی یک سیگنال برای آپاپتوز و ایجاد التهاب در سلول عمل می کنند که موجب فعالسازی مسیرهای آبشاری آپاپتوز در سلول می گردند. علاوه بر این، کاهش انرژی اثر سوئی بر روی تمامی فرآیندهای التیام دارد [۹۲]. مطالعات نشان داده است یک ساعت پس از تزریق اگزوزوم ها میزان ATP و NADH و همچنین فسفریله کردن مسیر Akt، GSK-۳B افزایش می یابد و استرس اکسیداتیو و فسفریله کردن مسیر c-JNK کاهش می یابد. در نتیجه التهاب موضعی و سیستمی پس از ۲۴ ساعت بعد از تزریق کاهش می یابد. این مشاهدات نشان دادند که اگزوزوم های سالم باعث بازگشت انرژی زایی، کاهش استرس اکسیداتیو و فعال کردن سیگنال های بقای سلولی گردیده و از این رو موجب ارتقاء عملکرد و بهبود قلب پس از انفارکتوس می شوند. چرا که اگزوزوم ها می توانند کاهش التهاب را از طریق کاهش تجمع سلول های ایمنی نظیر نوتروفیل ها موجب شوند. همچنین این نتایج نشان دادند که با تزریق درون رگی اگزوزوم ها در انتهای دوره ی ایسکمی اثربخشی افزایش می یابد[۳۱].
در تحقیقی دیگر نشان داده شد به عنوان فاکتورهای میتوژن در سنتز DNA، از ATP و ADP خارج سلولی بهره می بردند که می تواند با فاکتورهای رشد (EGF، TGF) در ترمیم و التیام اثرسینرژیسمی داشته باشد [۹۲, ۹۳]. در پژوهشی دیگر اثبات شد که گروه تیمار شده با ATP انکپسوله شده موجب بهبود زخم ها نسبت به گروهی می شوند که تنها با وزیکول های لیپیدی بدون ATP تیمار شده بودند [۹۴]. همچنین نشان داده شده است که نفوذ پذیری غشاء پلاسمایی به نوکلئوتیدها و دیگر مولکول های غیرقابل نفوذ زمانی که با ATP خارج سلولی در محیط قلیایی و کاتیون های دو ظرفیتی انکوبه شوند، افزایش می یابد [۹۵].مطابق گزارشات منتشر شده از آنجایی که نرخ انتشار ATP از غشاء بسیار پایین است و یک مولکول بسیار با ارزش برای سلول تلقی می شود و معمولا توسط حاملین غشایی جابجا می گردد. علاوه بر این بار منفی ATP، مانع ورود و خروج آزادانه از عرض غشاء می شود. بنابراین تزریق مستقیم داخل وریدی آن به تنهایی نتایج قابل قبولی نشان نداده است. درکل نیمه عمر ATP آزاد در جریان خون بسیار کم است و همین امر استفاده از آن را با محدودیت همراه می سازد. بنابراین پوشش دهی ATP و رسانش هدفمند آن در موضع می تواند راه کار مناسبی برای مشکلات مطرح شده باشد.(۴)

در این مطالعه، ما اگزوزوم‌های حاوی ATP را توسط پپتید (RGD) ۲۶،۲۷ بعد از تزریق وریدی به سمت بافت دچار آنفارکتوس قلبی هدایت می کنیم تا کارایی را افزایش داده و دوز موثر اگزوزوم‌های تحویل وریدی را کاهش دهیم . در میوکارد انفارکتوس شده به علت غیاب مداوم منبع اکسیژن، مسیرهای متابولیکی موقت تخلیه می‌شوند و پمپ‌های یونی وابسته به ATP در غشای خارجی میوسیت‌ها از کار می‌افتند، تعادل یونی آن‌ها از بین می‌رود، و متورم می‌شوند و در نهایت با آزاد شدن محتویاتشان می‌ترکند. بنابراین رساندن به موقع ATP به سلول های در استرس می تواند این سلول ها را احیا کرده و از وسیع شدن ناحیه ایسکمی جلوگیری کند. مطالعات اخیر از روش تزریق در محل اگزوزوم ها یعنی داخل میوکارد در ناحیه انفارکتوس استفاده کرده اند، اگرچه یک روش تهاجمی محسوب می شود. ما در این مطالعه قصد داریم از پپتید، (RGD) به منظور انتقال هدفمند اگزوزوم های مشتق از MSC و سلول های پیش ساز قلبی و غنی شده با ATP به صورت تزریق وریدی را به بافت دچار سکته قلب خرگوش برسانیم.
در مجموع، هدف از این مطالعه، تولید و پیوند اگزوزوم های مشتق از سلول های بنیادی مزانشیمی (MSC) وسلول های پیش ساز کاردیومیوسیت (CPC) بارگذاری شده با ATP است. در این مطالعه قصد داریم این اگزوزوم های بارگذاری شده با ATP را به وسیله پپتید RGD به بافت دچار سکته قلب خرگوش هدایت کنیم.